本研究探讨了产前暴露于表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对成年后代小鼠肝脏的影响。虽然EGCG以其健康益处而闻名，但其产前暴露对肝脏的影响仍不清楚。我们将妊娠C57BL/6J小鼠暴露于1 mg/kg EGCG中16天，以评估成年后代的肝毒性作用，我们通过转录组学和代谢组学阐明肝毒性机制。研究结果表明，产前EGCG暴露导致成年小鼠的肝体细胞指数降低，炎症反应增强，并通过增加糖原积累而破坏肝功能。我们综合组学分析揭示了肝脏糖脂代谢的关键通路的显著改变，如糖异生、胰岛素信号失调和肝脏炎症的诱导。此外，该研究发现Ppara的启动子甲基化水平与其mRNA水平之间存在负相关，这表明EGCG可以通过表观遗传修饰降低肝脏脂质含量。研究结果表明，产前EGCG暴露可能对成年人的肝脏产生不利影响，并强调有必要对怀孕期间摄入EGCG相关的潜在风险进行全面评估。
如图1所示，仅在成年雄性小鼠中，产前暴露于饮用水中的EGCG导致肝脏体细胞指数显著下降(12.0%)(图1A)。与对照组相比，EGCG暴露组成年雄性组血清的ALT和AST水平分别显著上调1.15倍和1.35倍，雌性组小鼠血清中ALT和AST水平分别上调1.20倍和1.39倍（图1B、C）。
图1 产前EGCG暴露对成年小鼠肝脏生理指标的影响。（A）肝脏体细胞指数。雄性（对照组，n=10;EGCG，n=9），雌性（对照组，n=9;EGCG，n=7）。（B，C）血清ALT和AST水平（n=7，每次处理4只母鼠，每只母鼠1-2只后代）。数据以平均值±标准差表示，使用未配对的双尾学生t检验显著性。∗p0.05，∗∗p0.01，∗∗∗p0.001，∗∗∗∗p0.0001。
为了研究产前暴露EGCG是否影响肝脏代谢物，我们采用UPLC/Q-TOF-MS/MS对EGCG组和对照组成年小鼠肝脏代谢物进行了非靶向代谢物检测。根据PLS-DA评分图，成年雄性小鼠（图2A）和雌性小鼠（图2D）对照组和暴露组之间的肝脏代谢物谱明显不同。根据VIP评分1的标准进行分析，牛磺酸在EGCG成年雄性小鼠中贡献最大，柠檬酸盐、谷氨酸、葡萄糖、3-磷酸、谷胱甘肽二硫化物、尿苷一磷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和乳糖的代谢产物具有特异性（图2B）。在雌性小鼠肝脏中，与对照组相比，EGCG暴露组的葡萄糖水平显著升高，次黄嘌呤、肌苷、琥珀酸、腺苷酸、牛磺酸、谷氨酸、乳酸、尿酸、ADP-核糖、谷胱甘肽二硫化物和乳糖的代谢产物也有显著差异(图2E)。我们使用 MetaboAnalyst 5.0软件生成差异代谢物（DEMs）的热图，直观地识别成年雄性（图2 C）和雌性（图2 F）中对照组和EGCG暴露组之间代谢物水平变化的趋势。代谢组学结果显示，成年雄性EGCG暴露组与对照组存在62种DEMs，尤其是糖代谢的代谢物（即葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸和果糖的积累）。我们在成年雌性中鉴定出的41种DEMs中，有15种代谢物（腺嘌呤、硫酸吲哚、尿酸盐、蛋氨酸亚砜、羟苯乳酸、5-甲基胞嘧啶、乙醛酸、N-乙酰柳氨酸、磷酸胆碱、葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸、果糖-6-磷酸、壬二酸盐、乙酰赖氨酸、葡萄糖-6-磷酸）显著增加，而26种代谢物（10-羟基癸酸盐、1-氨基环丙烷羧酸盐、水杨酸盐、a-KG、3-羟甲基戊二酸盐、氧化谷胱甘肽二硫化物、葡萄糖酸盐、2-HG、胸苷、衣康酸盐、肉碱、甘氨酸、鸟嘌呤、2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖胺、鸟苷、左旋多巴、次牛磺酸、甲戊酸盐、嘌呤、戊二酰肉碱、脱氧尿嘧啶、葫芦巴碱、邻苯二甲酸盐、N，N-二甲基精氨酸、谷氨酸盐、次牛磺酸）显著降低。
图2 产前EGCG暴露对成年小鼠肝脏代谢物的影响。基于成年雄性（A）和雌性（D）肝脏代谢物的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。成年雄性（B）和雌性（E）的PLS-DA VIP评分图。成年雄性（C）和雌性（F）的差异表达代谢物（DEMs）热图。表达用Z评分表示（组间相对上调：红色，下调：蓝色）。
我们观察到EGCG暴露小鼠肝脏中炎症细胞(图S1)和中性粒细胞(雄性2.71倍，雌性3.43倍)(图3A)的增加，以及胶原纤维(雄性3.04倍，雌性2.26倍)的沉积(图3B)，表明产前暴露于EGCG可能诱导后代小鼠肝脏炎症和纤维化。在EGCG暴露的雄性小鼠的肝脏中，纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-Sma）和胶原蛋白III（9.42和1.78倍）的表达增加支持了这一结论（图3C）。此外，我们在暴露于EGCG的雄性小鼠的肝组织中检测到IL-6（一种促炎细胞因子）水平升高（2.18倍）。转录组学分析进一步显示，与NAFLD相关的基因在EGCG暴露组中上调（图3E至H），这些基因包括Cox6a1、Cyp2el、Cox8a和Cox4il，它们参与各种代谢过程，可能有助于NAFLD的发展。这些发现表明，产前暴露于EGCG可能对肝脏健康产生不利影响，促进炎症、纤维化，并可能导致NAFLD的发展。
图3 产前暴露于EGCG增加了成年后代小鼠的肝脏炎症和纤维化。（A）对照组和EGCG暴露组的MPO染色肝脏切片的代表性图像和MPO染色定量数据。（B）对照组和EGCG暴露组的Masson染色肝脏切片的代表性图像和定量Masson染色数据。比例尺：50 μm。（C）雄性和雌性小鼠肝α-SMA和III型胶原的蛋白质印迹分析。n=每组4只小鼠。（D）对照组和EGCG暴露组小鼠肝脏IL-6水平。n=每组6只小鼠。数据以平均值±标准差表示，使用未配对的双尾学生t检验分析显著性。*p0.05，**p0.01，***p0.001。(E, F)RNA-seq数据的基因集富集分析。n=每组3只小鼠。NES，归一化富集得分。(G, H)与对照组相比，EGCG暴露组非酒精性脂肪性肝病前15个上调基因的热图。
在暴露于EGCG的雄性和雌性小鼠中观察到的肝糖原含量显著增加（3.04和1.61倍）（图4A），表明产前EGCG暴露促进了肝脏中糖原的积累。参与糖原生物合成过程的基因如Ppp1r3b、Khk、Gck和Adra1b的上调支持了这一观点，这些基因在糖原合成过程中发挥作用。在糖原分解代谢过程中，暴露于EGCG的雄性小鼠中Akt2、Rb1cc1、Agl和Pygl的表达水平下调，而在雌性小鼠中，Rb1cc1、Agl和Pygl的表达水平上调（图4B和C）。这些基因与糖原分解有关。此外，暴露于EGCG的雄性和雌性小鼠的G6P蛋白水平显著增加（2.73倍和1.26倍），表明糖原代谢增强。此外，PCK2的蛋白表达仅在暴露于EGCG的雄性小鼠中显著增加（3.25倍）（图4D）。综上所述，这些结果表明，产前暴露于EGCG会影响后代小鼠肝脏中的糖原代谢，通过改变糖原合成和分解过程导致糖原积累增加。
图4 产前EGCG暴露增加了成年后代的肝糖原积累。（A）雄性和雌性小鼠的肝糖原含量。n=每组6只小鼠。（B、C）来自转录组学分析的糖原代谢靶基因的热图。（D）G6P和PCK2蛋白的蛋白质印迹分析。n=每组4只小鼠。数据以平均值±标准差表示，使用未配对的双尾学生t检验分析显著性。*p 0.05，**p0.01，***p0.001。
油红O染色显示EGCG暴露的雄性和雌性小鼠肝脏中的脂滴分别减少了27%和21%（图5A）。此外，暴露于EGCG的雌性肝脏中的TG水平显著降低了30%（图5B）。RNA测序分析（RNA-seq）通过鉴定参与脂质代谢各个方面的基因的下调表达水平，进一步支持了这些发现。在雄性中，与肝脂质合成相关的Acacb、Slc27a1、Fabp5和Fabp4等基因的表达水平降低。此外，参与脂质氧化的基因，包括Ppara、Acad11、Cpt1a和Acox1，表达也下调。与肝脏脂质储存和转运相关的基因，如Apob、Pnpla2、Rxrb、Lpl、Cyp4a10、Plin2和Ehhadh、Acaa1b、Ddhd2、Acsl4、Cd36和Cyp7a1，在雄性中表达水平显著降低（图5C）。在雌性中，与脂质合成相关的Lpin1和Fads2的基础表达水平高于对照组。然而，与脂质储存和运输相关的基因被下调（图5D）。基因表达分析证实了转录组学分析结果，显示出与脂质代谢相关的特定基因的相对表达水平的一致趋势，包括脂质合成（Acacb，Lpin1）、脂质氧化（Ppara，Mlycd）、脂质储存（Acad11，Apob）和脂质转运（Pnpla2，Ddhd2）（图5E和F）。总体而言，这些发现表明，产前暴露于EGCG可能通过脂质合成、氧化、储存和运输过程的改变导致肝脏中脂质积累减少。
图5 产前EGCG暴露降低了成年后代小鼠的肝脏脂质。（A）肝油红O染色结果。比例尺：50 μm。n=每组4只小鼠。（B）雄性和雌性小鼠的肝脏TG含量。n=每组6只小鼠。（C，D）脂质生物学方面相关基因的热图。（E，F）与脂质代谢相关的几种DEGs的RT-qPCR。n=每组6只小鼠。数据以平均值±标准差表示，使用未配对的双尾学生t检验分析显著性。*p 0.05，**p0.01，***p0.001。
该研究在生物分子之间建立了拓扑网络，如图6A所示。然。
