黄芩是一种功能性食品，具有治疗多种疾病的潜力。黄芩可分为两种类型：子芩（条形）和枯芩（木质部腐烂）。子芩主要用于治疗下焦大肠热证，枯芩用于治疗上焦肺热证。目前，子芩与枯芩差异的实质依据尚不明确。我们通过非靶向代谢组学技术结合无标记蛋白质组学方法，分析它们之间代谢产物积累和蛋白质表达的变化。结果表明，差异代谢产物和蛋白质主要富集在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、苯丙素、类黄酮、黄酮和黄酮醇、异黄酮和花青素生物合成途径中。这些结果揭示了黄芩在不同生长年份的变化，为黄芩选择合适的采收期提供了参考。
我们采用电喷雾电离，在正、负离子模式下对黄芩进行了非靶向液质分析。前期实验结果表明，阳离子模式比阴离子模式可检测到更多的化合物。表S1包含代谢物名称、峰积分值、序列号等详细信息。我们初步鉴定了680种代谢物，使用HMDB数据库注释到了其中的192种代谢物，分类如图S2A所示。
我们使用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等多元统计分析方法，对处理后的代谢物进行分析，以降低数据维度，提高数据的可解释性和有效性。为了评价代谢组学性能，我们将QC样品加入到每批黄芩样品中。QC样品的典型总离子色谱图如图S2B和S2C所示。我们对样品（包括QC）进行主成分分析，以确定组间的总体代谢物差异和组内代谢物变化（图S2D和S2E）。主成分分析得分图显示，QC样品聚集在中心，枯芩和子芩样品被清楚地分为两个部分，每个样品的六个重复相互重叠，这表明代谢组学分析是可重复和可靠的。如图S2F和S2G所示，每个主成分分析得分图中的所有样本都在95%置信椭圆内。PC1明确区分了枯芩和子芩，分布结果表明，不同黄芩样品之间存在显著差异，代谢产物可以将不同黄芩样品有效分离。样本之间的确切差异通常不能用无监督的PCA算法来解释。在本研究中，我们使用OPLS-DA模型进行了有监督判别分析，以测量不同黄芩样品中代谢物的转化程度。图S2H和S2I显示了样本组间的高度差异，不同组之间有明显差异。通过交叉验证和响应排序检验（RPT），OPLS-DA模型没有显示出过拟合（图S2J和S2K）。基于这些结果，OPLS-DA被证明预测模型有效，可用于分析枯芩和子芩之间的代谢差异。
枯芩和子芩的代谢产物比较如表S2所示。根据代谢组学分析结果，枯芩和子芩之间有227种不同累积的代谢产物，其中上调127种，下调100种（图S2L）。我们将这些代谢物与HMDB数据库进行比较，共注释到70种代谢物。结果表明，在枯芩和子芩的比较中，差异积累代谢物的前10个分类分别是：羧酸及其衍生物（13）、脂肪酰基（11）、黄酮类化合物（7）、有机氧化合物（6）、嘧啶核苷（3）、吡啶及其衍生物（3）和类黄酮（2）（图1A）。
代谢途径富集分析可以深入了解不同样本中代谢变化的潜在机制。我们使用KEGG数据库匹配代谢物的代谢途径，并对前20种不同代谢途径进行富集分析，以更直观地分析枯芩和子芩之间的差异（图1B）。结果表明：13个KEGG途径具有显著不同的富集模式（P 0.05），这些途径分别是：氨酰基tRNA、氰基氨基酸代谢、ABC转运蛋白、苯丙氨酸代谢、α-亚麻酸代谢、精氨酸、己烯类、二芳基庚烷和姜酚、酪氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，类黄酮、硫代葡萄糖苷以及黄酮和黄酮醇生物合成（表S3）。
在本研究中，我们鉴定出5931个肽和5029个独特肽，使用至少一种独特肽鉴定出了样品中的962种蛋白，其中908种蛋白被定量。结果显示，大多数检测到的肽的长度在9-20个氨基酸之间（图S3A），蛋白质的相对分子量主要在21- 61 kDa之间（图S3 B）。枯芩和子芩之间独有和共有的上调和下调蛋白的数量如图S3C所示。枯芩和子芩之间具有丰度差异的蛋白质汇总在表S4中，其中，我们确定了537种（213种上调和324种下调）。与子芩相比，枯芩中具有丰度差异的蛋白的下调数量大于上调数量，这表明黄芩对根系生长发育的代谢途径有复杂的调节作用。
具有丰度差异的蛋白质的功能分类如图2A所示。从枯芩和子芩中鉴定出的主要功能类别是：碳水化合物转运代谢（11.6%）、翻译后修饰、蛋白质折叠和伴侣蛋白（9.94%）、能量生成和转换（6.19%）、氨基酸转运代谢(5.63%)、胞内转运、分泌和小泡运输（4.50%）以及信号转导机制（3.19%）。不同生长阶段代谢产物变化背后的机制可以通过识别参与关键生物过程的不同丰度的蛋白来解释。然而，我们也发现了许多未知的功能蛋白，它们可能涉及黄芩根部空洞化的各种生物过程。
根据GO富集分析结果，可将具有丰度差异的蛋白质分为三组（生物过程、细胞组成和分子功能）（图2B）。我们通过对枯芩和子芩的GO注释，共发现有746个上调和1069个下调的蛋白，其中13个被分配到生物过程组（主要是代谢过程、细胞过程、生物调节、对刺激的反应和定位）、2个被分配到细胞成分组（细胞解剖实体和含蛋白复合物），以及13个被分配到分子功能组（主要是催化活性、结合活性、抗氧化活性、分子功能调节剂和分子转导活性）。我们根据对具有丰度差异的蛋白质进行GO富集分析，发现不同生长年份的黄芩根中的蛋白质表达可能与催化活性、细胞解剖实体、代谢过程、细胞过程、结合、生物调节、对刺激的反应、含蛋白复合物、定位、抗氧化活性、分子功能调节和分子转导活性有关。
图2（A）具有丰度差异的蛋白质的功能分类，（B）具有丰度差异的蛋白质的功能注释，（C）具有丰度差异的蛋白质的KEGG途径富集统计。
我们使用KEGG数据库绘制所有丰度差异的蛋白，以进一步研究不同生长年份黄芩的代谢途径。枯芩和子芩产生了443种不同丰度的蛋白，共有90种途径（表S5）。枯芩和子芩的前20个KEGG途径如图2C所示，包括半胱氨酸和蛋氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、硫代谢、谷胱甘肽代谢、植物激素信号转导、色氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、嘧啶代谢、硒化合物代谢、泛酸和辅酶A生物合成、酪氨酸代谢，抗坏血酸和醛酸盐代谢、赖氨酸降解、维生素B6代谢、卟啉和叶绿素代谢、类黄酮生物合成、泛醌和其他萜类醌生物合成、C5支链二元酸代谢、磷脂代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。在这些代谢途径中，半胱氨酸和蛋氨酸代谢是显著富集的途径（P 0.05）。这些途径在黄芩生长发育的生理生化反应中起着至关重要的作用。
基于代谢组学和蛋白质组学数据，我们选择KEGG途径作为载体，并进行了综合分析。蛋白质组和代谢组中涉及的KEGG途径数量如韦恩图所示（图3A），圆圈中的交叉区域代表两个组学鉴定的差异积累代谢物和具有丰度差异的蛋白质所涉及的KEGG途径的数量。蛋白质组和代谢组共有38条常见途径，包括类黄酮生物合成、苯丙素生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、泛酸和辅酶A生物合成、糖酵解/糖异生等（表S6）。通过对这38条常见路径的进一步分析，我们确定了具有最多蛋白和代谢物的前20个KEGG途径（图3B）。此外，根据P值排名的前20个KEGG途径，如图3C所示，从下往上，柱越高，样品中的生物途径就越活跃。近年来，有人提出次生代谢对植物生长发育至关重要，以图3B和图3C的共同途径为次生代谢的主要途径，即类黄酮生物合成和苯丙素生物合成。
为了更好地理解代谢组学和蛋白质组学之间的联系，我们还使用Cytoscape软件对枯芩和子芩的差异代谢产物、具有丰度差异的蛋白质和KEGG途径进行了网络分析。图3D显示，查尔酮异构酶、过氧化物酶、谷氨酸/天冬氨酸-苯丙转氨酶和氯合酶不仅具有最低的P值，而且直接参与类黄酮生物合成和苯丙素生物合成途径。一种代谢产物可以与多种蛋白质结合，一种蛋白质在参与联合通路时也可以与多种代谢产物结合；因此，我们进一步将这些关键代谢产物和蛋白质与相关途径整合在一个网络中。图3E表明，关键途径主要参与类黄酮生物合成和苯丙素生物合成途径，以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、黄酮和黄酮醇、异黄酮和花青素生物合成（表 1）。基于以上结果，我们提出不同的生长年份可能对黄芩根中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、苯丙素、类黄酮、黄酮和黄酮醇、异黄酮和花青素的生物合成有显著影响。
图3（A）参与代谢物和蛋白质的KEGG途径的韦恩图，（B）含有最多的代谢物和蛋白质的前20个KEGG通路，（C）富含代谢物和蛋白质的前20个KEGG通路（按P值排序），（D）使用所有差异代谢产物和蛋白质构建的网络分析，（E）关键途径中代谢物和蛋白质之间的网络分析（AST：天冬氨酸氨基转移酶；CAD：肉桂醇脱氢酶；CHI：查尔酮异构酶；HCT：莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶；PAT：谷氨酸/天冬氨酸-苯丙转氨酶，POD：过氧化物酶；3AT：花青素3-O-葡萄糖苷6′-O-酰基转移酶；UGT79B1：花青素3-0-葡萄糖苷2′-氧基转移酶）。
通过对代谢组学和蛋白质组学分析，我们表征了关键代谢途径的差异调节，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、苯丙素、类黄酮、黄酮和黄酮醇、异黄酮和花青素生物合成。这些结果有助于阐明黄芩生长发育的复杂调控机制。
几种芳香族氨基酸（如：苯丙氨酸和酪氨酸），会在植物生长发育过程中积累，并可作为植物的初级和次级代谢产物的生物合成前体。前期研究表明，在逆境生长阶段，苯丙氨酸和酪氨酸显著减少。如图 4所示，我们在本研究中也观察到了类似的结果：枯芩和子芩的苯丙氨酸和酪氨酸含量显著降低。同时，天冬氨酸转氨酶（AST）和谷氨酸/天冬氨酸-苯甲酸氨基转移酶（PAT）的表达以及苯丙酮酸的含量在枯芩和子芩中也显著下调。
苯丙氨酸和酪氨酸减少可能有两个原因。首先，AST、PAT和苯丙酮酸是苯丙氨酸和酪氨酸生物合成的最后一步，在这一过程中发挥着至关重要的作用。因此，苯丙氨酸和酪氨酸含量的降低可以通过AST、PAT和苯丙酮酸的表达降低来解释。第二，苯丙氨酸和酪氨酸可以用作苯丙烷生物合成途径中合成木质素的前体。因此，木质素合成酶含量的降低可能导致枯芩中苯丙氨酸和酪氨酸的下降。
木质素是木质部的主要成。
