二磷酸核苷(NDPs)、三磷酸核苷(NTPs)及其缀合物是地球上所有生命形式所必需的生物分子。在自然界中，它们在DNA和RNA合成、能量供应、细胞外信号传导、初级代谢和神经传递等过程中发挥关键作用。因此，它们被广泛应用于生物化学和分子生物学中。该生物医学研究领域正迅速成为治疗许多疾病的一种最有应用前景的模式。然而，由于核苷酸依赖性酶和受体在体内的快速代谢，它们的研究往往存在问题，因此需要更稳定的类似物和增强的药理学特性。在核酸领域，手性硫代膦 (PS)作为一类具有增加代谢稳定性的，经过临床验证的物质，具有举足轻重的地位。尽管如此，但是这类物质的引入同时也不可避免的设计到膦所带来的额外的手性中心。事实上，大量的研究已经证明，不同的膦立体异构体的硫代物可以在生物系统中表现出显著不同的性质。此外，PS类似物还可以在寡核苷酸和小分子候选药物中的设计和筛选中发挥重要作用。尽管硫代改性NDPs和NTPs具有独特的增强功能，但它们的化学合成仍然面临着巨大的挑战。它们的合成往往需要用到湿敏试剂和空气敏感试剂、具有极低的化学选择性、需要多步反应、可扩展性很低，最重要的是，传统的合成方法缺乏立体化学控制。同时，这些分子的高度极性使得纯化具有也具有极高的挑战性。为此，在这项工作中，来自美国斯克利普斯研究所的Phil S. Baran教授团队开发了新型的手性P(V)-α-硫代二磷酸和三磷酸转移试剂，并实现了一种立体控制、模块化和可扩展的方法来合成这些有价值的结构。该工作以题为“Stereocontrolled access to thioisosteres of nucleoside di- and triphosphates”发表在《Nature》上。文章第一作者是来自中国的
为了开发可以合适的硫代转移试剂，作者进行了大量尝试。首先，以Azidothymidine (AZT)分子为模型底物，使用装载转移试剂的核苷，没有观察到α-硫代二磷酸产物。紧接着，作者认为唯一可行的替代方法是原位制备手性α-硫代二磷酸转移试剂。这种方法中，相比于磷酸酯离去途径（途径B）产生的产物更易醇解，试剂与核苷进行有效结合释放OTP主链的方案（途径A）似乎更加可行。因此，为了实现这一方案，首先需要解决的问题是开发一种非吸湿性和骨架稳定的磷酸盐供体，以及一种可以与弱亲核试剂发生干净反应的试剂。磷酸四丁基铵首先被排除在外，这是因为它具有高吸湿性，得到的试剂不稳定，在几分钟内就完全分解/水解。同时，二烷基磷酸酯也被证明是非常差的亲核试剂，仅可以导致少量的产物形成，而且不能避免产物的水解。作者评估了一系列单烷基磷酸酯，因为其所产生的带电中间体不太可能进行醇解。但这些单磷酸酯要么对碱性不稳定，要么难以发生去保护反应。最终，作者找到一种对位苄氧基取代的单磷酸酯8g，其具有较好的稳定性和反应性，适用于该过程的所有关键阶段。但该化合物的纯化受到试剂10产生的副产物的影响，因此作者重新开发了一种*试剂11来规避这种影响。11具有更活性的离去基和氢化核心，可以与较弱的亲核试剂(如8g)顺利反应，从而产生更高的产率和更清洁的反应曲线。在优化条件下，过量核苷(2.0-2.5当量)的使用对于简化原本极其艰巨的纯化过程至关重要。因此，分离的产量以8g为基础，因为它(以及11)是更昂贵的成分。该反应可在空气中进行，可以适用于大多数溶剂，仅在几种极性、非质子溶剂(乙腈、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜)中产率略有下降。
使用这种合成方法，各种不同的α-硫代修饰的二磷酸和三磷酸类似物(包括所有天然存在的DNA和RNA构建模块和一些非天然的类似物)都具有优异的立体选择性(非对映体比(d.r) 20:1)，重要的是，用于生成α-硫代DPS和NTP的通用方案也可以应用于相关的二核苷酸硫代异构体(硫代硫代NDP和硫代硫代NTP)。大部分产物可以采用简单沉淀法纯化，其次采用离子交换色谱法。相比传统方法，该合成方案极度简单的纯化方法可以大幅度降低相关产物的商业成本。
另外，本文报道的手性硫代磷酸盐转移试剂具有高度的O选择性，并且不需要保护胺基(即鸟苷和腺苷)。但该试剂不能区分伯醇和仲醇(伯:仲，~2:1选择性)，因此需要保护羟基以避免复杂的产物混合物。广泛使用的苯甲酰酯由于对DBU的稳定性，较低的吸湿性和核苷在有机溶剂中的溶解度增加，并且在转移过程中易于去除而成为首选。乙酰基、叔丁基二甲基硅基(TBS)、4,4′-二甲氧基三甲基(DMTr)和正构酯保护基也适用于该方案。作者使用该方法制备(1-2 mmol)合成了几种高价值的核苷二磷酸和三磷酸立体硫异构体(20、26、36、38、40和41)，其中两种是市售的(20和26)，证明了其可扩展性。单批制备的立体(SP)-α-硫代ADP（20,620毫克)和(RP)-α-硫代TTP(26,560毫克)目前的市场价值约为75,000美元。相比之下，当前方法的原材料成本仅是这一方法的一小部分(约100美元)，并且只需要单一的、低成本的二乙基氨基乙基(DEAE) sephadex柱基纯化，而不需要产量有限且耗时的HPLC。这同样适用于thioUppU(单批制备38,870毫克)，它作为更简单的标准DNDP在商业上可用，每毫克约900美元。这显示了该方法的巨大应用潜力。此外，下表中还列出了已知的一些母体，但由于缺乏可靠的合成方法而没有办法获得它们相应的立体硫代异构体，但这些化合物异构体都可以找到直接的生物学应用，使用该工作所发展的合成策略，可以方便的得到这些化合物，给未来大规模核酸药物的开发开辟了巨量的机会。
腺嘌呤和尿嘧啶核苷酸是激活G蛋白偶联P2Y受体和/或配体门控P2X受体离子通道的有效细胞外信号分子。这些受体与炎症、疼痛、免疫和癌症相关的疾病有关。此外，核苷酸可以被胞外核苷酸酶去磷酸化，胞外酶最终将其转化为相应的核苷，例如由促炎ATP42产生抗炎腺苷。因此，核苷酸类似物作为P2Y和P2X受体和外核苷酶的调节剂是研究这些蛋白质在疾病中作用的重要工具化合物。另外，它们作为药物也具有很大的潜力。为了评估硫代磷酸酯部分的结构对核苷酸硫代异构体生化特性的影响，在P2X和P2Y受体的背景下，作者评估了腺苷(20和32)和尿苷(12、13、24和25)核苷酸类似物的生物活性。作者观察到P2X3和P2X4受体的立体选择性(从3到5倍)，有利于RP异构体。硫代异steric腺苷核苷酸类似物是有效的P2Y13受体激动剂，具有非常高的立体选择性(化合物32 (RP SP)的178倍)，证明了控制膦立体化学的重要性。作者还惊讶的发现对于P2Y14受体，UTP衍生物(RP)-24和(SP)-24分别比亲本UDP类似物，即异构体α-硫磷酸盐(RP)-12和(SP)-12具有更高的亲和力。对于P2Y14, 2-硫代和RP-α-硫代磷酸修饰的组合具有协同作用，导致UTP衍生物24具有非常高的半最大有效浓度(EC50 = 37 nM)亲和力(与天然底物UDP和UDP-葡萄糖相比，活性提高了100倍)。值得注意的是，对于P2Y6受体，立体化学偏好是相反的，SP-α-硫代磷酸盐比RP异构体具有更高的亲和力。这种SP增强非常明显，SP-α-硫代udp类似物的效力比RP类似物提高了100倍。为了进一步了解硫效应在P2Y14受体中巨大影响的分子基础，作者预测了最有效的硫异体(RP)-24的结合模式。基于所预测的结论，作者假设与UTP相比，(RP)-24的结合亲和力的提高可能是由于疏水效应。RP非对映体可能导致更紧密的结合。
外核苷酶，包括磷酸酶，是调节细胞外嘌呤能受体配体浓度的水解酶，是癌症免疫治疗的靶点。研究了不同家族的NTP-和ndp -水解酶对腺苷和尿苷核苷酸硫异构体(12,13,20,24,25和32)的水解稳定性;在某些情况下定性显示立体化学增强。与天然核苷酸相比，所研究的硫代异构体对NPP1水解的抗性增强，它们可能作为开发NPP1的先导结构。作者对上述硫代异构体对外切酶的抑制效能进行了评估，结果显示对NPP1和CD73的抑制效果最好。因此，这两种化合物都可以作为先导支架，用于开发针对这些外核苷酸酶的治疗药物。
高效COVID-19 mrna疫苗的开发是该领域前所未有的突破，为这一治疗方式开辟了新的途径，包括预防性疫苗、免疫疗法、基因替代疗法等。为广泛的临床应用实现mRNA的足够疗效和持久性，依赖于使用各种化学修饰来调节mRNA的特性，从而影响其疗效(稳定性、翻译效率和免疫原性)。为此，人们正在研究许多mRNA的化学修饰方法，其中最有希望的是天然mRNA5 -端的硫代异构体，通过用硫原子取代5 ，5 -三磷酸链非桥接位置的氧原子而获得，这些化合物显示出优异的生物学特性，如降低对脱帽酶的敏感性和增加对翻译起始因子eIF4E的亲和力等。然而，由于该化合物在最后的合成步骤中形成了两种非对映体，其中只有一种具有临床应用价值，因此最终产物的纯化需要费力的手性HPLC分离。为了证明这种方法对立体特异性mRNA类似物合成的实用性，作者也以两种非对映异构体的形式制备了两个mRNA硫异构体(40和41)。
总结，该工作通过开发简单的硫代磷酸转移试剂为具有特定立体构型的核苷酸硫异构体提供了方便、模块化的途径。反应进行迅速，具有完整和可编程的立体化学控制，很容易纯化，而不需要繁琐的HPLC纯化。本工作的结果表明了在多种不同环境下，位于硫代磷酸盐基团的单个磷原子的立体化学构型对生物功效有深远的影响。鉴于核苷酸及其衍生物的生物学功能的巨大应用范围，这种合成方案为我们提供了在多个治疗领域探索新途径和新方法的机会。
